Come noto dai post precedenti la colonia in questione può trovarsi in soluzione acquosa (terreno liquido) o su terreno solido. Vediamo tutti i passaggi per contare i batteri presenti in soluzione o sulla colonia sul terreno solido.
1. Trasferimento della colonia in appropriato brodo di coltura
Se si dispone di una coltura in terreno liquido si salti questo passaggio.
Ci si munisca della piastra sulla quale si trova la colonia di batteri che vogliamo contare. Preparare 10ml di nutrienti broth con la seguente composizione:
COMPOSIZIONE (per 100ml di terreno liquido)
- Colla di pesce..................0,5g
- E. di carne.......................0,5g
- Cloruro di sodio..............0,5g
- Acqua distillata...............q.ba a 100ml
far bollire il tutto per 30 minuti per ottenere un grado sufficiente di sterilità.
Versare il terreno in una provetta e chiudere la provetta.
A questo punto è necessario munirsi dell'ansa precedentemente costruita (vd. post precedenti), sterilizzare tale ansa su fiamma e pois freddarla in acqua, nel frattempo aprire la piastra in cui è presente la colonia e prelevare la colonia con l'ansa. aprire la provetta e immergere l'ansa facendo scivolare la colonia nel terreno liquido. è bene fare tutte queste operazioni in prossimità della fiamma con cui si è sterilizzata l'ansa. Chiudere la provetta nel minor tempo possibile e agitarla per favorire il disciogliendo della colonia. d'ora in avanti seguire i passaggi successivi comportandosi come si avessimo una COLTURA LIQUIDA.
2. Operazioni preliminari
Inizia ora la conta propriamente detta, materiale:
- 3 piastre di Petri
- 3 provette
- Siringa sterile da 20ml (va bene anche da 15ml o da 30-40ml)
- Acqua distillata
- Nutrient Agar
- Ansa
- Pentolini
Riempire un pentolino di acqua distillata, coprirlo con un coperchio e mettere sul fuoco. In tempo breve l'acqua inizierà a bollire, lasciamola bollire mentre facciamo le altre operazioni preliminari.
Se le piastre di petri non sono già sterili è bene sterilizzarle con alcool e risciacquarle con acqua.
Mettere le 3 provette in forno a 125°C e lasciarle lì.
Preparare 100 ml di Nutrient Agar in un altro pentolino secondo la seguente composizione:
COMPOSIZIONE (per 100ml di terreno solido)
- Colla di pesce..................0,5g
- E. di carne.......................0,5g
- Cloruro di sodio..............0,5g
- Agar Agar.......................1-1,5g
- Acqua distillata...............q.ba a 100ml
raggiungere l'ebollizione e lasciar bollire il terreno per almeno 15 minuti. Passato questo tempo colare il terreno bollente nelle tre piastre precedentemente sterilizzate e chiudere le piastre, lasciar raffreddare il terreno per 3 ore.
Una volta tirate fuori dal forno chiudere le provette ancora calde con i relativi tappi in gomma e lasciare che si raffreddino. Il pentolino d'acqua che avevamo messo a bollire ci è ora utile: munirsi della siringa da 20 ml e aspirare 10 ml di acqua bollente (è necessario stare molto attenti perché potrebbero verificarsi schizzi, NON UTILIZZATE SIRINGHE CON CAPIENZA MINORE DI 15 ml), con l'ago della siringa bucare il tappo in gomma della provetta e inserire i 10ml di acqua sterile bollente, mano a mano che viene introdotta l'acqua lasciare che la siringa si riempia di aria (altrimenti l'eccessiva pressione potrebbe far esplodere la provetta). Ripetere la stessa operazione per le altre 2 siringhe. Alla fine dell'operazione lasciar raffreddare le provette per 2-3 ore.
3. Aliquote biologiche
Una volta completato il punto 2 nominare con un pennarello indelebile le 3 provette con i seguenti nomi: x10, x100, x1000. è necessario fare altrettanto con le tre piastre di Nutrient Agar ormai solido.
munirsi di una siringa sterile e prelevare 1ml di campione biologico (il brodo della coltura di cui vogliamo contare i batteri), immettere questa quota nella provetta x10 senza aprirla ma bucando il tappo in gomma. Fatta questa operazione CHIUDERE LA SIRINGA E RIPORLA MOMENTANEAMENTE NELLA SUA CARTA, agitare la provetta x10 in modo da ottenere una soluzione omogenea.
Prendere nuovamente la siringa passando il suo ago su fiamma e poi sfreddarlo in acqua e prelevare una aliquota di 1ml dalla provetta x10 sempre bucando il tappo (bucare il tappo è meglio che aprire la provetta perché ne impedisce la contaminazione), inserire questa quota nella provetta x100 ed estrarre poi la siringa come già spiegato. Agitare la provetta x100 ottenendo una soluzione omogenea.
Passare di nuovo su fiamma l'ago della siringa e, dopo averlo sfreddato, inserirlo nuovamente nella provetta x100 e prelevare una aliquota di 1ml, estrarre la siringa e inserirla nella provetta x1000 rilasciando la aliquota al suo interno, agitare bene la provetta x1000 per ottenere una soluzione omogenea e poi prelevare 1ml. Buttare quesa ultima quota da 1ml.
Abbiamo così 3 provette in cui i batteri sono presenti a concentrazioni diverse.
4. Semina su piastra
Munirsi dell'ansa e accendere la fiamma. sterilizzare l'ansa alla fiamma e raffreddarla in acqua. Aprire velocemente la provetta x10 e immergere l'ansa, aprire la piastra x10 e seminare con l'ansa secondo il metodo riportato in figura. è importante svolgere tutti questi passaggi vicino a una fiamma. Chiudere ermeticamente la piastra e incubare a 37°C per 48 ore.
5. Conta delle colonie:
Dopo 48 ore apprezzeremo questo tipo di crescita:
è ora necessario contare le colonie, la prima cosa da fare è munirsi di un pennarello indelebile nero e fare un puntino sul retro della piastra dove osserviamo le varie colonie, alla fine ad ogni colonia corrisponderà un puntino, prendiamo la piastra x1000, contiamo i vari puntini e moltiplichiamo il risultato ottenuto x 1000, se ad esempio abbiamo 57 colonie potremo affermare che nella colonia o nella soluzione di partenza c'erano circa 57'000 individui.
Se le colonie non sono troppe potremmo riuscire a contarle anche nella piastra x100, in quel caso il numero di batteri sarà dato dal prodotto fra il numero delle colonie e la diluizione, ovvero 100.
Abbiamo così contato il numero di batteri presenti. prelevando solo 1ml dalla coltura madre.
Il metodo è difficile e se sono stato poco chiaro vi invito a scriverlo in commenti!
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