Visualizzazioni di pagine: ultimo mese

venerdì 8 febbraio 2013

L'isolamento dei batteri (1° metodo)

Ciao a tutti! Credevate che fossi sparito? E invece no, eccomi di nuovo qui a scrivere post per il mio sito!!
Dove eravamo rimasti l'ultima volta? Ah già, vi avevo detto "La prossima volta sceglieremo il batterio che ci piace di più e lo ISOLEREMO, cioè lo faremo crescere meglio grazie ad un terreno SELETTIVO! Ma per oggi basta così!" E allora che aspettiamo? Cominciamo!

Per chi non conoscesse il post precedentemente nominato si tratta del post "Coltivare batteri su un terreno di coltura standard"
è innanzitutto giusto, nonché necessario spiegare cos'è l'ISOLAMENTO di un batterio, e cosa serve.
Come avrete sicuramente notato nella vostra piastra con il campione prelevato dalla pelle è cresciuto di tutto: colonie di ogni forma e di colore e consistenza diversi, si è così passati da un terreno fresco e pulito ad una gelatina sporca, inacidita (spesso rinsecchita) e non più favorevole per la vita, ma sicuramente avete visto che c'è una colonia che preferite, magari vi attrae di più il colore, magari l'aspetto, la grandezza o la velocità di espansione e vorreste studiarla meglio... Ma come facciamo se è stata praticamente circondata e, a volte travolta da un' altra colonia, spesso una muffa? Questa è la stessa domanda che mi posi io tempo addietro, per osservare quel batterio, con le sue colonie in tutta la sua bellezza è necessario un isolamento!
"L'isolamento è quel processo attraverso il quale otteniamo una coltura batterica in cui prolifera una ed una sola specie di batteri"
E sapete una cosa? Per isolare un batterio esistono ben due modi!!
-Isolamento su terreno selettivo
-isolamento su terreno elettivo
In questo post ci concentreremo sul primo tipo di isolamento che, a mio avviso, è il più semplice, anche se a volte può risultare ridondante a causa della contaminazione.

Cosa ci serve?
- Una piastra con una coltura già pronta
- 4 piastre di Nutrient Agar (ora vi spiego cos'è)
- Una fiamma
- L'ansa di ferro (attache ripiegata)

Cominciamo l'esperimento!!
Inizio dicendovi che il Nutrient Agar, anche chiamato N.A. è un terreno di coltura standard, ed è quello che abbiamo realizzato nel post precedente (vedi "Coltivare batteri su un terreno di coltura standard"), quindi per rifarlo servono gli stessi ingredienti con gli stessi dosaggi e 4 piastre nuove.
Teniamo le quattro piastre di N.A. chiuse e sterilizziamo con una fiamma la nostra ansa, lasciamo la fiamma accesa e apriamo la vecchia piastra, quella che contiene le varie colonie, tocchiamo con l'ansa SOLO LA COLONIA CHE CI INTERESSA, dopodiché richiudiamo la piastra e buttiamola* NON APPOGGIATE L'ANSA DA NESSUNA PARTE, E FATELA STARE ESPOSTA ALL'ARIA IL MENO POSSIBILE, e, soprattutto, vicino alla fiamma, non spostatevi MAI dalla fiamma. a questo punto apriamo la prima piastra RIGOROSAMENTE VICINO ALLA FIAMMA e strofiniamo il terreno di coltura con l'ansa facendo il movimento esposto in figura...

Ripetiamo l'operazione per le altre tre piastre, chiudiamole e lasciamole stare per 48h, a questo punto inizieranno a comparire le prime coloni, e, se avrete fatto tutto correttamente saranno solo del batterio che vi interessa!
Se non capite qualcosa o volete chiarimenti NON ESITATE!! COMMENTATE COMMENTATE E COMMENTATE, l'unica domanda stupida è quella che non viene fatta!!

Francesco
*A breve scriverò un post sulle normative da seguire per smaltire gli scarti degli esperimenti...

16 commenti:

  1. Ciao,
    per un po' di tempo sono sparito per vari problemi, però adesso sono ritornato.
    Ieri sono andato a bologna, ho comprato 50 g di agar agar, poi la signora mi ha regalato una bustina con su scritto "EM" (microorganismi effettivi), dentro ci sono:
    cianobatteri, L.Casei, lieviti e alri batteri non specificati.
    La bustina è sottovuoto e dentro c'è una "melma" marroncina, la signora quando me l'ha data era fredda, adesso è fresca.
    Mi potresti dire come procedere?

    RispondiElimina
    Risposte
    1. Ciao Matteo!
      Innanzitutto ti faccio notare che se non vuoi continuare la conversazione qui io ho una mail: francesco.zorutti@gmail.com dove possiamo discorrere in privato, ad ogni modo, se preferisci farmi le tue domande qui sono ugualmente ben accette!
      Allora, focalizziamoci prima sul terreno, preparalo miscelando:
      - 1g di estratto di carne
      - 0,5g (e assolutamente non di più!) di cloruro di sodio (ovvero sale da cucina)
      - 1,5g di mannitolo
      - 1,5g di agar agar
      - Acqua distillata qba a 100ml
      Il mannitolo lo trovi in farmacia, lo vendono in panetti ad un presso assolutamente irrisorio, i batteri lo adorano, e grazie ad esso si evita l'aggiunta del saccarosio (zucchero comune) che facilita la crescita di muffe.
      Miscela il tutto e gira molto bene fino ad ottenere una soluzione omogenea (l'agarosio NON si scioglierà, non preoccuparti), metti tutto sul fuoco e aspetta che raggiunga l'ebollizione.
      CONSIGLIO: l'agar agar bolle in maniera "violenta" quindi se usi un bricco o un contenitore troppo basso uscirà tutto! fa in modo che il tuo contenitore sia riempito con i 100ml di terreno per non più di 1/4 della sua altezza!
      Una volta raggiunta l'ebollizione spegni il fuoco e versa il terreno il più velocemente possibile nei contenitori per le colture...
      QUALI CONTENITORI USARE: l'ideale sarebbero le piastre di Petri, ma se non le trovi compra 4 contenitori per la raccolta delle urine (quelli sono gia sterili). Chiudi bene i contenitori per la raccolta delle urine e inclinali di 45° appoggiandoli su qualcosa, aspetta 1 ora.
      dopo un'ora ti accorgerai che il terreno si è completamente gelificatoe che mettendo dritti i contenitori la gelatina mantiene un'inclinazione di 45° così che tu la possa vedere senza aprire il coperchio.
      ora devi lavorare vicino una fiamma, anche il fornello della cucina va bene, prendi un fermaglio per fogli e allungalo (in uno dei post precedenti c'é scritto come fare), passa sulla fiamma quest'ansa artigianale e poi immergila in acqua fredda, a questo punto apri la bustina e immergi l'ansa nella "melma", chiudi la bustina e strofina l'ansa sul terreno del primo contenitore, richiudi ermeticamente il contenitore e mettilo in un punto caldo (NON ALL'APERTO!). Ripeti l'operazione per tutti i contenitori rimanenti.
      COME CONSERVARE IL CAMPIONE: per conservare il campione (la melma) fai le seguenti cose: prepara una pentola con dell'acqua, metti un vasetto per la marmellata dentro l'acqua e metti il tutto sul fuoco, fai bollire per 15 minuti poi spegni e chiudi il vasetto con un tappo adeguato e NUOVO, senza aspettare che si freddi. Quando si sarà freddato togli il tappo e buttalo, versa dentro la "melma", e richiudi con un nuovo tappo, il tutto il più velocemente possibile e vicino una fiamma.
      aspettiamo 24 ore e vediamo cosa succede!!!
      Fammi sapere:
      Quando li semini
      Se ci sono ulteriori domande che vuoi farmi
      Se c'è qualche punto in cui non sono stato chiaro!

      Elimina
    2. Ciao e grazie della risposta,
      per i contenitori io uso delle specie di ciotoline in pyrex non trasparenti,
      per sterilizzarle le metto nel microonde alla massima potenza per 5 min.
      le lascio raffredare lì dentro, poi dopo preparo tutto il terreno aspettando che si raffreddi e dimmi tu se per sigillarle andrebbe bene una pellicola trasparente.
      Ciao
      P.S.: sono molto casalingo per i materiali perchè non trovo mai niente
      in questa maledetta cittadina.
      P.P.S.: Preferirei scrivere qui in quanto con l'email non mi "destreggio"
      bene.

      Elimina
    3. Possiamo continuare a scrivere qui senza problemi!
      Io consigliavo i contenitori per la raccolta delle urine perché sono più pratici in quanto gia sterili all'acquisto, poi fai tu, la pellicola secondo me non va bene, rischi che ti si infetta tutto...
      Fammi sapere!

      Elimina
    4. Mi sa che prenderò i vasetti per la raccolta delle urine, però per fare la coltura aspetto perché ho la febbre a 38 e non voglio contaminare tutto.
      XD.
      Ciao

      Elimina
  2. ciao, puoi darmi qualche dritta sulla coltivazione dei batteri anaerobici ?

    RispondiElimina
    Risposte
    1. in effetti volevo qualche suggerimento su come sviluppare questo:
      http://www.instructables.com/id/How-to-isolate-plastic-degrading-bacteria-from-soi/

      Elimina
    2. Ciao Soren!
      Guarda io ho studiato e fatto colture di batteri anaerobici fino a circa un anno e mezzo fa, poi mi sono dedicato ad altre tipologie di esperimenti, ma ti prometto che mi vado a ripassare tutto quello che avevo fatto io e mi studio la pagina della URL che mi hai inviato, ma tu prima dimmi, se posso chiedertelo, perché tutto questo interesse nelle colture di batteri anaerobici? Se non ricordo male non era così facile, comunque non preoccuparti, in settimana mi ripasso e magari pubblico qui qualche protocollo utile!

      Elimina
  3. grazie mille Francesco, sono rimasto affascinato dalla possibilità di degradare la plastica (sopratutto PET) ai suoi elementi primari grazie all'utilizzo dei batteri. In internet si trovano vari studi (per la verità molto embrionali) e volevo valutare la possbilità di verificare qualcosa. Parlano quasi tutti di batteri anaerobici ma mi interesserebbe (anzi sarebbe meglio) con batteri aerobici.

    RispondiElimina
    Risposte
    1. Bhe certamente con gli aerobici sarebbe tutto molto più facile!
      P.S.: Sto ricomponendo i pezzi, durante la settimana prosiam tento di pubblicare un protocollo un po' più chiaro e minuzioso, poi però mi fai sapere eh!
      :)

      Elimina
    2. assolutamente si ... ti do anche la mia mail:
      a.kierkegaard.a@gmail.com

      teniamoci in contatto...

      Elimina
  4. Ciao, Francesco,
    mi sono imbattuto nel tuo interessantissimo blog in un momento di revival della mia mai sopita passione per tutto ciò che attiene al mondo miscroscopico.
    Quando ero ragazzo passavo ore ed ore a osservare qualsiasi cosa al microscopio; casus belli: avevo letto il bellissimo "I cacciatori di microbi" di Paul de Kruif (lettura che, per inciso, fece convertire alla microbiologia una lunga teoria di mostri sacri come, per citarne uno: Albert Sabin!).
    Purtroppo, anche a causa di una vista che ha tracollato un pochino, il microscopio era finito, come dire, "in soffitta".
    Da pochissimo ho deciso di ripartire verso gli esotici micro-lidi con lancia in resta e nuova dotazione tecnologica(le videocamere digitali permettono di limitare i problemi legati alla vista).

    Ho comunque pensato di cominciare con una strumentazione di medio-basso profilo.
    e.g. http://tinyurl.com/myukffr
    aggiungendoci un po di vetreria e magari un incubatrice home made imbastita con una yogurtiera modificata(progetto ravanato su www),

    Che ne pensi?

    Un salutone,
    Michele Collatina
    ---
    Per aspera ad dis...astra




    RispondiElimina
    Risposte
    1. Ciao Michele!
      Dunque, il microscopio che hai scelto non lo definirei proprio una strumentazione medio-bassa, voglio dire che per fare eserimenti casalinghi è anche troppo buono (è vero pure che se possiamo attrezzarci al meglio perché non farlo?)
      Per l'incubatrice ti sconsiglio la yogurtiera, possiamo costruirne una decisamente migliore con un termostato, una lampadina ad incandescenza, una scatola di polistirolo e un po' di filo, io l'ho fatto ed il risultato è stato davvero notevole!
      Per la vetreria o comunque il materiale e i reagenti dipende di dove sei, io sto a Roma e mi è abbastanza facile reperire tutto, bisogna anche tener presente la possibilità di acquistare materiale presso negozi online che possono essere anche molto buoni in termini di prezzo e di spedizione.
      Vedrai che la vista non sarà un problema! Anzi, è un bene che tu e la scienza vi siate riavvicinati, la microbiologia poi è un mondo a sé! Poi tu considerando le citazioni nel corpo del messaggio e la frase finale mi sa tanto che sei un letterato, mi sbaglio?
      ---
      Per te inizierò a trattare la struttura fondamentale
      Di cielo e di dèi, disvelerò i principi di tutte le cose,
      Donde Natura crea tutte le cose, le accresce e alimenta
      >>Lucrezio

      E per qualsiasi cosa, questa è la mia mail
      francesco.zorutti@gmail.com

      Elimina
  5. Grazie per la risposta, Francesco!

    Riguardo al microscopio, dato che il mio obbiettivo elettivo sarebbe l'osservazione dei batteri, ho deciso di utilizzare come entry-level il Seben, poichè, spigolando nei forum specialistici, ho letto che può essere "upgradato" sensibilmente modificando la fonte di illuminazione.

    http://myttex.net/forum/Thread-Seben-sbx5-passo-passo-fotografico-upgrade-illuminazione

    Giusto per curiosità: qual è la tua dotazione "micro-lentifera"?

    Passando all'incubatrice, hai ragione: esistono delle soluzioni più performanti: non da ultima il ricorso a cavetti riscaldanti per terrari + termostato(sempre spendendo poche palanche).

    Sono però un po' titubante a portare avanti il progetto di coltivare i batteri.

    Più che altro per ragioni di sicurezza.

    Questo articolo mi ha un po' allertato...
    http://www.microbehunter.com/safety-issues-in-microscopy/

    Per il momento ho deciso di soprassedere e dedicarmi all'osservazione
    di campioni "raccogliticci"(yogurt & affini).

    Almeno fino a quando non sarò un po' più consapevole(anche con l'ausilio dei tuoi consigli) di questo nuovo "mondo".

    Anch'io abito a Roma...
    (attendo dritte, trick 'nd tips!)

    Sono un'informatico, ma penso che il Latino sia una lingua tutt'altro che morta;
    mi sono anche cimentato in un progetto per apprenderlo tramite un corso che, nel mio piccolo(il cervello...), ritengo veramente innovativo
    "Lingua latina per se illustrata" di Hans H. Orberg.

    Il problema, però, è che ho troppi interessi e poca temperanza...

    Il brocardo che hai letto in chiusura è una mia parafrasi del motto dei gesuiti "Per aspera ad astra".

    Per vie tortuose spesso, al posto di giungere agli astri otteniamo(ottengo)...disastri! ;.)

    Ti scriverò senz'altro.

    Grazie K.

    Un salutone,
    Michele

    RispondiElimina
  6. Ciao Francesco
    Girovagando in rete mi sono imbattuto nel tuo blog... Peccato che non hai pi´ continuato a scrivere articoli! Sono diplomato come perito chimico/biologico, e sicuramente la mia materia preferita a scuola era la microbiologia! Ricordando con nostalgia i giorni in cui "spignattavo" con terreni di coltura e piastre petri, ho pensato di cercare in rete una valida alternativa casalinga.

    RispondiElimina